Современные краткосрочные тесты для выявления мутагенов и канцерогенов окружающей среды.

         

                  

         Для оценки мутагенных свойств химических соединений (ХС) предложено около 200 различных тест-систем, многие из которых хорошо разработаны и  нашли широкое применение. Однако до настоящего времени нет универсальной тест-системы, которая могла бы выявить все основные типы генетических повреждений. Это обстоятельство ведет к необходимости использования в работе по выявлению и оценке мутагенности исследуемых ХС целого набора методов. При этом в качестве тест-объектов служат самые различные виды организмов от микроорганизмов до трансгенных животных и клеток человека  в условиях in vitro   и in vivo.Большинство  широко используемых в настоящее время тест-систем  разработаны были  еще в 70-х годах и, соответственно, подробно описаны в различных методических руководствах и обзорах (1,2,4).

     Основные тестирования на мутагенность большого числа ХС, которые в той или иной форме введены в окружающую среду или будут введены в результате возрастающего  химического синтеза, были сформулированы  тоже еше в начале 70-х годов Бриджесом (7) и Фламмом (14).Эти принципы основаны на идее поэтапного тестирования, когда  каждый  из этапов является просеивающим по отношению к  последующему этапу, то есть тестирование ХС на следующем этапе проводится только в случае, если оно  проявило мутагенную активность на  предыдущем этапе. Такое тестирование предполагает  создание набора или батареи тестов, в котором первый этап состоит из простых и высокочувствительных методов, а последующие этапы  состоят из методов  по возрастающей сложности проведения и филогенетической близости к человеку. Следует отметить, что  батарея тестов должна содержат максимально информативный набор методов, позволяющих регистрировать различные типы генетических изменений,  в то же время достаточно экономичных, чтобы обеспечить реальность выполнения программы испытаний. С другой стороны, набор методов, схема испытаний, анализ и оценка результатов должны быть одобрены и утверждены государственными органами, чтобы  все  системы оценки в рамках поставленной задачи имели официальный характер и обеспечивали унификацию проверки на мутагенность во всех лабораториях.

      Анализ  принятых в различных странах, включая США и страны Европы, схем тестирования как для отдельных программ (например, для оценки генетической безопасности фармакологических средств или пестицидов), так и для оценки мутагенного и канцерогенного потенциала ХС - загрязнителей окружающей среды, показывают, что на первом этапе обычно используется бактериальный тест Эймса салмонелла/микросомы, а на втором - тест на микроядра или хромосомные аберрации в клетках костного мозга мышей (5,8). Причем как первый этап, так и второй этап может быть дополнен методами учета точковых мутаций в клеточных культурах  (обычно используют клеточные линии  V79, СНО,  L5178 ТК +/- ).   Третий этап состоит  исключительно из тестов учета мутаций в половых клетках, причем основным тестом является метод учета доминантных летальных мутаций у мышей. Таким образом, основной костяк любой батареи тестов  составляют методы учета мутационных событий. Однако  в ряде случаев используются и такие косвенные методы, как тесты на СХО, на репаративный синтез  и разрывы ДНК, а также  на аддукты ХС с ДНК  как  в соматических, так и  в половых клетках (тесты на генотоксичность).

       Принятые в различных странах схемы тестирования, и, соответственно, набор методов,   последовательность тестирования и правила принятия решения о прекращении или продолжении испытаний, несколько различаются. Эти различия сложились исторически в 70-80 – годах прошлого  двадцатого века, в период бурного развития работ  по апробации  и валидизации  тест-систем и их батерей. В настоящее время  эти различия являются препятствием на пути к унификации схем  тестирования в период необходимости формирования общих требований к химической безопасности, в том числе и к генетической безопасности.

      Создание в начале 70-х годов тест-систем, способных учитывать метаболическую  трансформацию ХС    in vitro (например, тест  Эймса Salmonella/микросомы), показало, что многие канцерогены являются также и мутагенами (18 ). Это привело к тому, что тестирование  ХС на генетическую активность стали проводить  в двух целях. Во-первых, для регистрации собственно мутагенов, то есть ХС, потенциально способных  индуцировать мутации в половых клетках человека, и, во-вторых, для выявления потенциальных канцерогенов, то есть ХС, способных индуцировать мутации в соматических клетках человека. Теоретическое обоснование использования тестов на генотоксичность  для выявления потенциальных канцерогенов связано с представлением  о том, что в основе развития большинства опухолей, индуцированных  канцерогенами (по крайней мере, на стадии инициации), лежит  генотоксический эффект. Сами же тест-системы, используемые  для предсказания канцерогенной активности, получили статус "краткосрочных" тест-систем (КСТ),   под которым  следует понимать ускоренные методы (по отношению к стандартным методам определения канцерогенной активности на животных), позволяющие предсказывать канцерогенный риск для человека тех или иных ХС и основанных на определении биологической активности, прямо или косвенно связанной с канцерогенным потенциалом этих соединений (  2 ). Разработка КСТ  для предсказания  канцерогенной  активности  основывается  на представлениях о механизмах действия канцерогенов, то есть, если конечным критерием тестирования на канцерогенность в опытах на животных является опухоль, то в КСТ- это те генетические или иные эффекты, которые ведут к ее возникновению.

        Таким образом, тесты на генотоксичность и их батарей могут быть использованы для определения как мутагенного,  так и канцерогенного потенциала ХС. Все зависит от схемы тестирования. Если для предсказания канцерогенного потенциала достаточно одного или двух этапов тестирования (на  1-м этапе  тестирование проводится в тесте  Эймса  и/или  на клеточных культурах, на 2-м этапе для тестирования используются животные и  регистрируется индукция  микроядер или хромосомных  аберраций в клетках костного мозга мышей), то для предсказания мутагенного потенциала для  половых клеток человека необходима оценка мутагенной активности в половых клетках   животных.

       Следует подчеркнуть, что  широко используемые КСТ и подходы  к оценке мутагенного и канцерогенного потенциала, основаны на достижениях науки  70-х годов. Однако хорошая проработанность протокола проведения тестирования и валидизированность  самих  КСТ, а также наличие   достаточно солидной базы данных по результатам исследования генотоксичности с помощью этих тестов тысячи ХС делает их  вполне применимыми и сегодня.

      Благодаря достижениям  в технологии рекомбинантной ДНК в течение последних  2-х десятилетий произошли существенные изменения в области молекулярного генетического  анализа  и  цитогенетики. Новые методические приемы позволили вводить чужеродные гены в клетки млекопитающих и конструировать сигнальные системы для мутационного анализа.  Так, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования ДНК  по сути дела сделали революцию в этой области и в настоящее время широко используются для определения типа мутаций в сайтах или кодонах их локализации. Одновременно были достигнуты существенные успехи в изучении механизмов развития опухолей. Если  в течение многих десятилетий развитие опухолей рассматривали как следствие изменений стадий прогрессии и развития опухолей, то в настоящее время больше внимания привлекает точка зрения о том, что рак является следствием ошибки в нормальном жизненном цикле клетки  ( 9  ). Так, изменения в контроле роста клеток может быть результатом функциональных изменений в белках, влияющих на «контрольные точки» или  альтернативные пути клеточного деления. Эти функциональные изменения являются часто следствием мутации  в критических сайтах генов, которые изначально  были идентифицированы как онкогены или антионкогены, то есть опухоль-супрессорные гены (16). Генетические изменения именно в  критических сайтах таких генов, по-видимому, имеют  непосредственное  отношение к развитию опухолей, тогда как генетические изменения в других частях генома не имеет или имеет мало последствий. Например, мутации в критических сайтах  опухоль-супрессорного гена р53 предрасполагают к развитию широкого спектра опухолей у человека и, особенно, лимфолейкозов и опухолей молочной железы (16,21). Многочисленные исследования функции онкогенов и антионкогенов показало, что они, как правило, кодируют белки, участвующие в сложной системе  позитивной и негативной регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки.

   Технология рекомбинантной ДНК позволяет конструировать клетки и организмы, содержащие чужеродные гены и  создавать   новые тест-системы для обнаружения мутагенного  или канцерогенного  потенциала ХС. Созданы рекомбинантные клеточные системы, в которых  репортерный ген находится под контролем промоторов, которые активируются под действием генотоксичных ХС. Экспрессию репортерного гена отслеживают биохимическими методами.  Наиболее  ярким примером является  бактериальный  SOS-хромотест, разработанный в 70- и 80-е годы, в котором  экспрессия  галактозидазного гена свидетельствует об активации генов    SOS-ответа (22).

     Ряд трансгенных мышиных моделей  были  созданы  позже на таком же принципе. Трансгенные мыши  Big Blue  и  Mutamouse  содержат в своем  геноме множественные тандемные дупликации  бактериального  lac-гена (19). Наиболее распространенная модель Big Blue  имеет в своем геноме шаттл вектор фага  l  ( l LIZ), который в качестве мишеня содержит ген lacI,  а в качестве репертора - ген lacZ. После обработки мышей изучаемым агентом, выделяется геномная ДНК из  клеток интересующих  исследователей тканей и затем, используя  упаковочный экстракт фага,  из этой ДНК выделяют  вектор lLIZ.  Инфекция клеток E.coli SCS-8  этим  фагом позволяет обнаруживать фаги, несущие мутантный ген lacI. Если нормальная функция гена –репрессора  lacI  нарушена, то экспрессируется  ген lacZ, продукт которого, b -галактозидаза, легко обнаруживается по голубому цвету фаговых бляшек в присутствии хромогенного субстрата Х-gal. Подсчет отношения мутантных голубых бляшек к бесцветным немутантным бляшкам позволяет определить частоту мутации  в интересующей ткани (25). В настоящее время с помощью этой модели исследована  мутагенная активность  в различных органах мышей ряда  известных канцерогенов, как афлатоксин В1, 7,12-диметилбензантрацен  и другие (11,15,27). Ценность  данной модели заключается в возможности оценивать мутагенную активность ХС в органах-мишенях и сравнивать ее  с активностью в других органах и тканях. Например, показано, что  уровень мутагенной активности афлатоксина В1    в различных органах мышей  коррелирует с  данными исследования органной  специфичности   его канцерогенного действия (11 ).

     Созданы трансгенные модели и для  тестирования канцерогенной

и опухоль-промотирующей активности ХС. Гетерозиготные по мутациям в опухоль- супрессорном гене р53 мыши имеют нормальный уровень спонтанных опухолей, однако отличаются  более укороченным латентным периодом развития опухолей. Такие животные успешно используются для тестирования  генотоксичных канцерогенов (10 ). Мыши TG.AC несут  в своем геноме v-HA-ras

онкоген слитый с промотором фетального глобинового гена (17). Трансген v-Ha-ras  активирован и содержит мутации в кодонах 12 и 59. Показано, что  этот онкоген не экспрессируется конститутивно в кожной ткани мышей  TG.AC  и  поэтому кожа необработанных мышей не отличается от кожи исходной линии мышей  FVB/N. Однако у гетерозиготных или гомозиготных мышей TG.AC , получавших повторяющиеся дозы 12-о-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат, или другие описанные в литературе промоторы опухолей  быстро  в течение 4-5 недель,  образуются плоскоклеточные папилломы, переходящие в злокачественные  опухоли (17). Эти  данные позволили сделать заключение о том, что  мыши TG.AC несут  в своем геноме активированный  онкоген, который  «преиницирует» мышей, то есть заменяет этап инициации (мутагенеза) канцерогенеза и тем самым  повышает эффект  действия промоторов.

      Число трансгенных моделей растет с каждым годом. И это является  результатом  не только развития новых методических приемов, но и  результатом расширения наших знаний о механизмах  развития опухолей и путей их  генетического контроля.

     В настоящее время  разработан ряд цитогенетических методов, основанных также на  новых технологиях  молекулярной биологии. Известно, что  гибридизацию ДНК можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или  хромосомных  препаратах  (гибридизация in situ). Метод, при котором в качестве зондов для гибридизации используют меченые флуорохромом препараты ДНК, получил название FISH-метод (fluorescein in situ hybridization). Анализируемые с помощью этого метода генетические мишени определяются составом зондов или последовательностей, представляющих собой  уникальные  фрагменты ДНК. При наличии зондов метод позволяет  исследовать распределение по геному повторяющихя последовательностей, клонированных фрагментов ДНК, внутрихромосомную локализацию уникальных генов, а также обнаруживать  крупные хромосомные изменения, включая делеции, дупликации и транслокации (26).   FISH-метод чаще всего используется для обнаружения анеуплодии в соматических или половых клетках человека и грызунов (28 ).Для этого используются ДНК-зонды к хромосомам, анеуплоидия по которым приводит к тяжелым последствиям у человека ( например, по хромосомам  21 , Х и У). Разработан  вариант метода, позволяющий оценивать наличие  анеуплоидии одновременно по трем хромосомам (  26). Важным аспектом использования FISH-метода является возможность сравнения генетических эффектов исследуемых ХС  одновременно в соматических и половых клетках.

       Метод анализа единичных клеток (Comet assay) позволяет идентифицировать генетические повреждения и нитевые разрывы ДНК в небольшом числе клеток из любого источника (человек или грызуны). Суть метода заключается в том, что образцы клеток лизируют в щелочных условиях и подвергают электрофорезу. Клетки, содержащие  разрывы ДНК проявляются в виде "кометы"  с хвостом из фрагментов ДНК, отходящих от основного ядра (12). Технология метода Comet assay, в отличие от метода  щелочной элюции  ДНК ( 1  ), достаточно проста и может быть использована для  широкого круга ситуаций, когда необходимо определить наличие  разрывов  и щелочелабильных  сайтов в ДНК клеток  из различных тканей  человека и животных. При этом анализируется только небольшое число клеток, что делает метод очень удобным при его использовании для тестирования  ХС на  генотоксичность  в клетках  млекопитающих.

       Современные методы анализа  ДНК-аддуктов  отличаются высокой чувствительностью и позволяют обнаруживать аддукты ДНК с генотоксикантом в пределах доз, которым подвергается человек (23). Метод особенно полезен когда природа аддукта известна и связь между аддуктом и конечным биологическим эффектом установлена.  Он успешно был использован для определения воздействия   на человека сигаретного дыма, профессиональных факторов, микотоксинов и химиотерапевтических агентов (20,24). Анализ аддуктов ДНК может быть одним из методов прямого сравнения экспериментальных данных на животных и данных на человеке  и представляет собой значительную ценность в разрешении вопросов дозовой  экстраполяции и оценки риска для человека.

     Для мутационного анализа в эндогенных генах человека наиболее   подходящим  является ген  hprt. Метод селекции   мутантных клеток  по этому гену хорошо разработан (6 ). Например, можно проводить  анализ этих мутаций в лимфоцитах человека, то есть в клетках легко доступной ткани человека, накапливающей мутации в течение многих лет.  Суицидная селективная система позволяет выживать клеткам с мутантным или неактивным геном  hprt, тогда как нормальные клетки в этих условиях погибают. Метод  позволяет отслеживать мутацию   в Х-хромосоме и, соответственно,  только у мужчин.  Данная система является пионером в мониторинге человеческих популяций и может быть полезной для проведения сравнения человек -экспериментальная модель.

      Проводится большая работа  по оценке возможностей новых методов и по их валидизации. Вышеописанные методы могут быть включены  или уже включены  в схему дополнительного тестирования. Следует отметить, что результаты, полученные с помощью дополнительных методов, могут играть в принятии решений такую же роль,  как и результаты, полученные с помощью стандартных методов. В этом отношении  большие перспективы  имеют тесты с использованием трансгенных животных, которые позволяют, по оценкам ряда исследователей, в течение  6 месяцев   получить информацию сравнимую с информацией, получаемой в результате биотестирования   на грызунах течение 2-х лет.

       Для успешной интеграции в схему  генотоксической оценки новые методы  должны быть усовершенствованы с  целью  упрощения технологии их выполнения, валидизированы  и приняты для общего использования, что требует   согласия  на  уровне научных, промышленных и правительственных кругов.

 

                                Список  литературы

 

1.     Абилев С.К., Порошенко Г.Г. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений. Итоги науки и техники ВИНИТИ, Токсикология, 1986, т.14, 173c.

2.     Белицкий Г.А., Худолей В.В., Краткосрочные тесты в системе выявления канцерогенных для человека химических соединений.// Вопросы онкологии. 1986, т.32, № 4, с.3-11.

3.     Горбунова В.Н. Роль онкогенов в инициации и промоции канцерогенеза.// Мутагены и канцерогены окружающей среды: Новые подходы к оценке риска для здоровья. Санкт- Петербург. 1998, с.34-59.

4.     Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических соединений. Гигиенические критерии окружающей среды. № 51. Женева, ВОЗ, 1982, 212с.

5.     Тарасов В.А. Принципы качественной и количественной оценки генетической опасности химических веществ. В кн.: Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека. М.,1994. с.3-66.

6.     Albertini R.J., Nicklas J.A., O’Neill J.P., Robinson S.H. In vivo somatic mutations in humans: measurement and analysis. // Annu. Rev. Genet., 1990, V. 24. P. 305-326.

7.     Bridges B.A. The three-tier approach to mutagenicity screening and the concept of radiation-equivalent dose. // Mutat. Res., 1974, V.26, P.335-340.

8.     Brusick D. Evolution of testing strategies for genetic toxicity. // Mutat. Res., 1998, V.205, N 1-4, P.69-79.

9.     Correa P. Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial process- first American Cancer Society award lecture on cancer epidemiology and prevention.//Cancer Res., 1992, V.52, P.6735-6740.

10. Dunnick J.K., Herbert R.A., Hardisty J.F., et.al. Phenolphthalein rapidly induces malignant hematopoietic tumors and loss of heterozigosity in p43 wild type allele in heterozigous p 53 deficient (+/-) mice. // Toxicol. Pathol., 1997,V.25, P.553-540. 

11. Dycaico M.G., Stuart G.K., Tobal G.M., et.al.  Species-species differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxine B1. // Carcinogenesis, 1996,V. 17, P.2347-2356. 

12. Faibairn D.W., Olive P.L., O’Neill K.L. The comet assay: A comprehensive review. // Mutat. Res., 1995, V.339, P.37-59.

13. Farber E. The multistep nature of cancer. // Cancer Res., 1984,V.44. P.4217-4223. 

14. Flam W.G. A tier sistem approach to mutagen testing. // Mutat., Res. 1974, V.26,  P.329                 

15.Gorelick N.J., Andrews J.L., Gu M., Glickman B.W. Mutational spektra in the lac I gene in skin from 7,12-dimetilbenz(a)anthracene-treated and untreated   transgenic mice. // Mol. Carcinogen., 1995,V.14, P.53-62.

16.Harris C.C. The 1995 Walter Hubert lecture molecular epidemiology of human cancer: insights from the mutational analysis of the p53 tumor suppressor gene. // Brit. J. Cancer, 1996, V.73, P.261-269.

17.Leder A., Kuo A., Cardiff R.D. et.al. V-Ha-ras transgene abrogates the initation step in mouse skin tumorigenesis: effects of phorbol esters and retinoic acid. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1990,V.87, P.9178-9182. 

18.McCann J.Choi E., Yamasaki E., Ames B.N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: Assay 300 chemicals// Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1975, V.72, P. 5135-5139.

19.Mirsalis J.C., Monforte J.A., Winegar R.A. Transgenic animal models for detection of in vivo mutaitions. //Annu. Rev. Toxicol.,1995,V.35, P.145-164.

20.Perera A.P., Dickey C., Santella R..et.al. Carcinogen- DNA adducts and gene mutation in foundry workers with low-level exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. // Carcinogenesis, 1994, V. 15, P. 2905-2910.

21.Pfeifer G.P., Denissenco M.F. Formation and repair of DNA lesions in the p53 gene: relation to cancer mutations? // Environ. Molec. Mutagenesis, 1998, V.31, P.197-205.

22. Quillardet P., Huisman O., D` Ari R., Hofnung M. SOS-Chromotest, a direct assay of induction of a SOS function in Escherichia coli K-12 to measure genotoxicity. //Proc. Natl. Acad.Sci.USA.,1982, V.79, P.5971-5975.

23.Randerath R., Randerath E.  ³²P- Postlabeling methods for DNA adduct detection: overview and critical evaluation . // Drug. Metab. Rev., 1994, V.26, P.67-85.

24.Stone J.G., Jones N.J., McGregor A.D., Waters R. Development of a human biomonitoring assay using buccal mucosa: comparison of smoking-related DNA adducts in mucosa versus biopsies. // Cancer Res., 1995, V. 55, P.1267-1270.

25.Tennant R.V., French J.E., Spalding J.W. Identifying chemical carcinogens and assessing risk in short-term bioassays using transgenic mouse models. // Environ. Health. Perspect., 1995, V.103, P.942-950. 

26.Van Hummelen P., Lowe X., Meistrich M.L., Wyrobek A.J. A novel multi-probe FISH procedure for the simultaneus detection of chromosomal aberrations, disomy and diploidy in sperm of Hodgking patients receiving chemotherapy. // Am.J. Human Genet., 1995, V.57 (Supple). A79. 

27.Walker V.E., Gorelick N.G., Andrews J.L. et.al.  Frequency and spectrum of ethylnitrourea-induced mutation at the hprt  and lacI loci in splenic lymfhocytes of exposed lacI transgenic mice. // Cancer Res., 1996, V. 56, P. 4654-4661.

28.Wyrobek A.J., Adler I.D. Detection of aneuploidy in human and rodent sperm using FISH and applications of sperm assay of genetic damage in heritable risk evaluation. // Mutat. Res., 1996, V.352, P.173-179.