Тест на индукцию мутаций у Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности при действии химических соединений и/или их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены пар оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма.

Для определения наличия промутагенных соединений, мутагенная активность которых связана с активностью их метаболитов, используется система метаболической активации in vitro. Если в тестируемом образце содержатся мутагенные или промутагенные химические соединения, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium [1,2].

1.1. Бактериальные штаммы

В работах по выявлению мутагенной активности химических соединений или сложных смесей обычно используют тест-штаммы S. typhimurium ТА ТА1535, ТА100, ТА1537, ТА97, ТА1538, ТА98, сконструированные в лаборатории Эймса из исходного штамма S. typhimurium LT-2 дикого типа (Ames et.al., 1971, 1973). Все эти штаммы содержат различного типа мутации в гистидиновом опероне, что приводит к их ауксотрофности по гистидину. Генотипы тест-штаммов S. typhimurium приведены в таблице.

Тестерные штаммы Salmonella typhimurium*

Ames et al., 1973; McCann et al., 1975; Levin et al., 1982.

Наличие мутагенного эффекта у исследуемых соединений учитывают по индукции ими обратных мутаций (реверсий) к прототрофности по гистидину.

1.2. Проверка генотипа тест - штаммов

Ауксотрофность по гистидину. Суспензию бактерий (0,25 мл) проверяемого штамма в буферном растворе переносят в пробирки с 0,6% полужидким агаром (в данном случае этот агар не содержит гистидина). Содержимое пробирок помещают на нижний 1,5% минимальный агар. После застывания верхнего слоя (20-30 мин) в центре чашки помещают стерильный диск из фильтровальной бумаги, на который наносят 0,05 мл раствора L-гистидина (4 мг/мл) или дистиллированной воды. Чашки инкубируют 48 часов. Наличие зоны роста культуры вокруг диска при нанесении на него гистидина и отсутствие такой зоны в контроле указывают на наличие у штамма ауксотрофности по гистидину.

Наличие у бактерий плазмиды pKM101. Бактерии штаммов TA 98 и TA 100 наносят штрихом на поверхность чашки с 1,5% МПА, содержащим ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Чашки инкубируют 18 часов при 37° С. Рост культуры по следу петли свидетельствует о наличии у бактерий фактора резистентности к ампициллину, т.е. плазмиды pKM101. При выращивании штаммов, несущих pKM101, в МПА или в жидкую среду вносят ампициллин (50 мкг/мл).

Наличие мутации rfa. Суспензию бактерий культуры переносят в пробирки с 0,6% МПА (0,25 мл суспензии в пробирку) и помещают на слой нижнего 1,5% МПА. На застывшую поверхность агара помещают стерильный бумажный диск, на который наносят 0,01 мл 0,1% раствора кристаллвиолета. Чашки инкубируют 18 часов при 37° С. Прозрачные зоны ингибирования роста культуры вокруг диска указывают на наличие, а отсутствие такой зоны – на отсутствие мутации rfa.

Все среды и растворы готовят на дистиллированной воде и после приготовления стерилизуют автоклавированием или кипячением.

Солевой концентрат: цитрат натрия трехзамещенный – 2 г, K₂HPO₄ × 3H₂O – 42 г, KH₂PO₄ – 18 г, (NH₄)₂SO₄– 4 г, вода – до 1000 мл, pH = 7.2.

Раствор глюкозы 20%: D-глюкоза – 200 г, вода – 800 мл.

Раствор сернокислого магния 1%: MgSO₄ × 7H₂O – 1 г на 99 мл воды.

Полужидкий минимальный агар 0,6%: агар – 7 г, NaCl – 6 г, вода – до 1000 мл.

Раствор гистидина 0,5 мМ: 9,6 мг L-гистидина солянокислого в 100 мл воды.

Раствор хлористого калия 0,15 М: 11,5 г KCl в 1000 мл воды.

Фосфатный буфер 0,2 М, рН 7,4: готовят отдельно 0,4 М раствор KH₂PO₄ (27,2 г в 500 мл воды) и 0,4 М раствор K₂HPO₄ × 3H₂O (45,6 г в 500 мл воды). Сливают 19 мл первого раствора и 81 мл второго. После измерения рН объем буфера доводят до 200 мл.

Раствор хлористого калия и хлористого магния для микросомальной активирующей смеси: KCl – 9,8 г, MgCl₂ × 6H₂O – 6,5 г, вода – до 1000 мл.

Приготовление бактериальной суспензии. 5 мл ночной культуры S.typhimurium вносили в 100 мл МПБ и подращивают до плотности 2-3 х 10⁸ клеток/мл при 37° С с подкачиванием. Культуру центрифугируют при 4000 об/мин 15 минут, осадок ресуспендируют в 30-40 мл 0,02М фосфатного буфера (для этого 0,2М буфер разводили водой 1:10), повторно центрифугируют в этом же режиме и ресуспендируют в том же буфере до плотности 10⁹ клеток/мл.

Приготовление микросомальной активирующей смеси. На 10 мл активирующей смеси берут 5 мл 0,2М фосфатного буфера, 1 мл раствора KCl и MgCl₂, 1 мл 50 мМ раствора глюкозо-6-фосфата, 1 мл 40 мМ раствора НАДФ, 3 мл фракции S-9 печени крыс.

Вначале в пробирки с агаром вносят 0,1 мл раствора тестируемого образца в необходимых дозах (0,1 мл раствора стандартного мутагена в необходимых концентрациях или 0,1 мл стерильного растворителя), затем – 0,1 мл суспензии бактерий. После этого вносили 0.5 мл микросомальной активирующей смеси. Все добавки делают вне бани, затем содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают на слой нижнего минимального агара на чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и разлива полужидкого агара на чашки не должна превышать 10-15 секунд. Чашки оставляют при комнатной температуре 30-40 мин и после полного застывания агара переносят в термостат на 37° С. Учет результатов проводят через 48-72 часа инкубации.

Параллельно в опыт включают варианты с активирующей смесью и без нее. В состав первой входят: суспензия бактерий, исследуемый препарат, фракция S-9 печени крыс и кофакторы. В вариантах без активации в пробирки с полужидким агаром вносят соответствующий объем стерильной воды. В вариантах без активации может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, т.е. соединений, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, т.е. соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при испытании образца в вариантах с активацией и без нее.

Для вариантов без активации используют 2-нитрофлуорен для штамма TA98, азид натрия для штамма TA100. Активность фракции S-9 контролируют, используя параллельно в вариантах с активацией и без нее бенз[а]пирен или 2-аминоантрацен, соответственно.

Данные должны быть представлены в виде количества ревертантных колоний на чашку. Как для тестируемого образца так и позитивных контролей указывается количество колоний для каждой чашки, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное отклонение. Если ни в одном из вариантов на данном штамме S.typhimurium не получено статистических значимых результатов, эксперимент прекращают. В случае обнаружения позитивного опыта опыт повторяют с целью подтверждения эффекта, причем работу ведут только на том штамме (штаммах), на котором выявлен эффект. Если максимальный эффект зарегистрирован на одной из промежуточных доз (такая ситуация бывает при работе с веществами, обладающими бактерицидными свойствами), прибегают к дроблению доз. При этом за среднюю дозу испытуемого вещества принимают дозу, на которой был выявлен максимальный эффект. При проведении повторного опыта используют шкалу доз в 2 и 5 раз меньше и больше средней дозы.

Если при проведении повторного опыта эффект не обнаруживается, проводится еще один дополнительный опыт результат которого сравнивают с первыми двумя экспериментами. Заключение о наличии или отсутствии мутагенной активности испытуемого соединения делают на основании двух опытов с совпадающими результатами. Для оценки результатов тестирования могут использоваться соответствующие статистические методы, например, попарных сравнений Даннета [4].

Протокол представления результатов оценки мутагенной активности химического соединения или иного образца в тесте по учету генных мутаций у бактерий должен содержать следующие сведения:

Вид____________________

Название _______________________________________

Откуда получено____________________________ ____

Растворитель________________________

Позитивный контроль___________________

Анализ данных литературы:

Дата проведения

дозы __________________________

количество чашек на дозу ________________

1.Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных штаммов (методические указания). М.1985, 34 с.