Методы изучения мутагенности факторов окружающей среды

 

Прогресс в изучении индуцированного мутагенеза связан с разработкой и постоянным усовершенствованием методов учета мутаций. Вначале эти методы разрабатывались для изучения генетических эффектов радиации, а затем для определения мутагенной активности алкилирующих соединений, таких как иприт, этиленимин и другие.

Методы экспериментального мутагенеза, позволившие к концу 60-х годов установить основные закономерности радиационного и химического мутагенеза, не были приспособлены к широкой проверке мутагенных факторов окружающей среды. Это обстоятельство привело к разработке большого числа тест-систем для испытания факторов окружающей среды на потенциальную мутагенную активность.

В настоящее время существует более 100 методов выявления и оценки мутагенности. При этом в качестве индикатора используют микроорганизмы, клетки млекопитающих и человека in vitro, растения, животных.

Разрабатываются методы молекулярной дозиметрии мутагенов с  клеточными макромолекулами (комплексов мутаген – ДНК, мутаген – белок или алкилированных соединений). Для этого применяют различные биохимические, иммунохимические методы и моноклональные антитела.

Химические вещества индуцируют мутации всех трех типов: генные, хромосомные и геномные. Универсального метода для обнаружения всех типов мутаций не существует. В этой связи для изучения мутагенности используют несколько методов, позволяющих регистрировать индукцию различных категорий мутаций. Однако тестирование сотен или даже тысяч химических соединений, поступающих в окружающую среду, невозможно проводить одновременно несколькими методами. К тому же изучение мутагенности на млекопитающих требует больших усилий, затрат и времени. Применение таких методов оправдано только при избирательном тестировании, т.е. при установлении очередности.

Один из подходов к установлению этой очередности заключается в ступенчатой системе испытаний, которая основывается на том, что фактически все генетически опасные вещества можно выявить с помощью простых или быстрых методов скрининга (просеивания). К скрининговым

тест-системам относятся методы, в которых в качестве индикатора мутагенности используются микроорганизмы. Мутагены, обнаруженные при скрининге, подвергают всестороннему исследованию на тест-системах, позволяющих учитывать индукцию генетических нарушений в клетках млекопитающих in vitro и in vivo.

3.1. Микробные тест-системы

Микроорганизмы входят в состав различных тест-систем с метаболической активацией in vitro и in vivo для индикации мутагенности химических соединений и их метаболитов. В качестве активирующей компоненты in vitro используются как гомогенаты тканей животных и человека, так и растений.

Для выявления мутагенов обычно используется тест Эймса Salmonella (микросомы и его различные модификации). Тест Эймса является одним из основных методов в скрининговых программах различных стран, когда нужно сравнительно быстро проанализировать большое число соединений и отобрать среди них те, которые потенциально могут явиться мутагенами для человека. Такое широкое применение этого метода связано с высокой корреляцией между канцерогенной и мутагенной активностями химических веществ.

Сущность теста Эймса Salmonella (микросомы) заключается в использовании двух основных компонентов: регистрирующего и активирующего. Регистрирующую часть составляет набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, способных регистрировать действие мутагенов, вызывающих как замены пар оснований в молекуле ДНК, так и сдвиг считывания генетического кода (B.N.Ames et al., 1973). Активирующий компонент включает постмитохондриальный супернатант гомогената печени крыс (фракция S-9) и кофакторы, необходимые для нормального функционирования микросомных систем окисления.

Схема постановки эксперимента приведена на рис.12. В расплавленный полужидкий голодный агар вносят при 43-45º 0,1 мл суспензии бактерий индикаторного штамма (2·108 клеток), 0,1 мл раствора испытуемого вещества в необходимой концентрации и 0,5 мл активирующей смеси, содержимое пробирки перемешивают и быстро наслаивают на нижний селективный агар. Чашки инкубируют при 37º в течение 48 часов и учитывают количество колоний- ревертантов от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Если вещество проявляет мутагенную активность, то количество ревертантов на опытных чашках превышает количество ревертантов в контроле.

Характеристика индикаторных штаммов Salmonella typhimurium приведена в табл.3. Все штаммы являются производными лабораторного штамма Salmonella typhimurium LT-2, от которого под действием различных мутагенных агентов были получены ауксотрофные по гистидину мутанты G-46, C-207, C-3076 и D-3052. Первый мутант имеет мутацию замены оснований в C-гене гистидинового оперона и ревертирует к прототрофности под действием мутагенов, вызывающих соответственно мутации замены пар оснований. Остальные мутанты несут мутации типа сдвига считывания в C (C-207 и C-3076) и D (D-3952) генах и ревертируют только под действием мутагенов, вызывающих этот тип мутаций (B.N.Ames, 1971).

Для повышения чувствительности этих мутантов к действию мутагенов в геном индикаторных бактерий были внесены дополнительные мутации, которые позволили получить широко используемые в настоящее время штаммы. Делеция galbiouvrB захватывает биотиновый оперон, часть галактозного оперона и ген uvrB. Последний дефект вызывает нарушение системы эксцизионной репарации, что еще более повышает чувствительность тестерных штаммов к действию ряда мутагенов. Мутация rfa увеличивает проницаемость клеточной стенки вследствие дефектов в полисахаридном слое.

Широкое применение нашли штаммы, несущие плазмиду pKM 101. Новые штаммы TA 100 и TA 98, полученные путем передачи этой плазмиды соответственно в штаммы TA 1535 и TA 1538, оказались более чувствительны к действию ряда веществ, чем исходные бесплазмидные штаммы.

Для составления активирующей смеси обычно берут S-9 фракцию, НАДФ и глюкозо-6-фосфат. Последние представляют собой НАДФН-генерирующую систему: НАДФН служит в качестве донора электронов, который переносится на цитохром Р-450.

В работе используют S-9 печени крыс, которым предварительно вводили индукторы микросом. В качестве индукторов применяют фенобарбитал, 3-метилхолантрен, полихлорированные бифенилы арохлор 1254 или совол.

При анализе эффективности выявления канцерогенов с помощью краткосрочного теста на генетическую активность принято определять специфичность (доля истинно отрицательных результатов, то есть процент генетически не активных соединений среди неканцерогенных соединений) и чувствительность (доля истинно положительных результатов, то есть процент канцерогенов, проявивших генетическую активность) метода. По оценкам, сделанным на основе анализа работ ряда лабораторий, специфичность и чувствительность теста Эймса составляют соответственно 76,4 и 77,4%.

Таблица 1.

Характеристика тест-штаммов Salmonella typhimurium

Штаммы

Мутации

Плазмида pKM 101

Тип регистрируемых мутаций

ауксотрофность по гистидину

rfa

uvrB

G-45

G-46

Замена оснований

TA 1950

G-46

+

–”–

TA 1534

D-3052

+

Сдвиг считывания

TA 1535

G-46

+

+

Замена оснований

TA 1536

C-207

+

+

Сдвиг считывания

TA 1537

C-3076

+

+

–”–

TA 1538

D-3052

+

+

–”–

TA 100

G-46

+

+

+

Замена оснований

TA 98

D-3552

+

+

+

Сдвиг считывания

 

Дальнейшее повышение чувствительности теста Эймса идет за счет конструирования новых штаммов. Известно, что тестерные штаммы S.typhimurium позволяют обнаружить не только мутагенную активность, но и устанавливать вероятные механизмы мутагенного действия, изучать зависимость активности от их химической структуры и метаболизм определенных групп соединений в бактериальной клетке. Все стало возможным в результате постоянного совершенствования тестерных штаммов путем введения новых мутаций, выгодно отличающих их от исходных. В настоящее время используют штаммы TA 1535, TA 100, TA 102, регистрирующие мутации типа замены пар оснований, TA 1538, TA 97 и TA 98 – мутации типа сдвига рамки считывания.

В отличие от других тестерных штаммов штаммы TA 102, TA 104 и TA 96 содержат в сайте мутации пары A-T. Первые 2 штамма имеют охра-мутацию hisG 428 и регистрируют мутации типа замены пар оснований (TA → ЦГ).

При создании штамма TA 102 использован новый подход (B.N.Ames et al., 1975). Часть гистидинового оперона, содержащего аллель hisG 428, была введена в мультикопийную плазмиду pBR322. Полученная таким образом плазмида pG1 была перенесена в бактерии с делецией гена hisG. В клетках штамма TA 102 содержится до 30 копий pAQ1 и 7-8 копий плазмиды pKM101. Увеличение дозы гена-мишени привело к увеличению чувствительности данного штамма в среднем в 5-12 раз по сравнению с изогенным штаммом, содержащим одну копию аллеля hisG 428 в хромосоме. Использование штамма TA 102 позволяет выявлять мутагенную активность гидроперекисей, перекиси водорода, хинонов, фенилгидразина, различных альдегидов и агентов, индуцирующих повреждение тимина (УФ, блеомицин).

Имеются попытки совмещения в одном тестерном штамме способности регистрировать как мутации сдвига рамки считывания, так и мутации типа замены пар оснований. Так, например, путем скрещивания штамма S.typhimurium TA 1535 со штаммом E.coli AG 249 сконструирован новый штамм E.coli AQ 262, содержащий в своем геноме 2 ауксотрофные мутации – hisG 46 и arg-2 (И.И.Лямкина и др.,1986). Первая из них позволяет тестировать вещества, индуцирующие мутации в результате замены пар оснований, вторая – выявлять способность к индукции мутаций типа сдвига рамки считывания.

Следует отметить, что введение новых штаммов S.typhimurium в стандартную схему скрининга химических соединений методом Эймса удорожает и усложняет работу несоизмеримо с объемом получаемой при этом информации. В этой связи возникает вопрос, можно ли обойтись минимальным набором тест-штаммов S.typhimurium, например, TA 98 и TA 100, и включить в схему тестирования второй скрининговый метод, дополняющий тест Эймса.

В качестве дополнительных методов могут быть использованы тесты, основанные на других принципах регистрации генетической активности генетических эффектов.

Известно, что большинство летальных и мутационных изменений ДНК, индуцированных генетически активными соединениями, могут быть восстановлены в клетках бактерий и животных. Этот интенсивно исследуемый в генетике феномен является основой широко распространенных методов тестирования химических соединений на ДНК повреждающую активность, которая определяется по селективному ингибированию роста бактериальных штаммов, несущих мутации в генах, контролирующих различные этапы репарации ДНК.

Тест имеет несколько преимуществ перед тестами на генные мутации. Например, размер мишени при этом (если летальные мутации не репарируются) значительно больше, чем отдельный мутантный локус и, возможно, мишень включает большее число премутационных изменений. Наблюдается немедленное фенотипическое проявление летальности и для постановки опыта необходимо лишь несколько сотен клеток.

Основные результаты тестирования ДНК-повреждающей активности химических соединений на бактериях приведены в отчете Агентства по охране окружающей среды США. В нем проанализировано 276 публикаций с данными изучения 611 соединений, которые испытаны на одном или нескольких наборах 55 пар нормальных и дефектных по репарации штаммов Escherichia coli и других микроорганизмов. Показано, что суспензионный вариант теста на повреждение ДНК более чувствителен, чем чашечный. 62% испытанных канцерогенов в данном тесте на штаммах E.coli, дефектные по репарации, дали положительные результаты.

Сравнительное изучение генетических эффектов лекарственгых и биологически активных соединений с помощью теста Эймса и суспензионного метода учета ДНК-повреждающей активности исследуемых соединений показало, что из 86 испытанных веществ мутагенную активность обнаружили 26, а ДНК-повреждающую активность – 27 препаратов (Л.М.Фонштейн и др.,1982). При этом в 19 случаях позитивные результаты, полученные в обоих тестах, совпали. 7 веществ, обнаруживших мутагенную активность, не проявили ДНК-повреждающей активности. В число таких соединений входят известные алкилирующие агенты тиофосфамид, фопурин, сарколизин и ронгерон. По-видимому, эти вещества в клетках E.coli не вызывают нерепарируемые летальные повреждения ДНК. 8 веществ, проявивших ДНК-повреждающую активность на E.coli, не индуцировали мутации у тест-штаммов S.typhimurium. В основном это были комплексные соединения платины и палладия. Процент совпадения положительных и отрицательных результатов в тестах на мутагенез и ДНК-повреждающую активность достаточно высок. Вместе с тем, для ряда соединений спектр положительных и отрицательных ответов, полученных этими методами, не совпадает. Это указывает на целесообразность применения обоих тестов для первичного выявления генетической активности химических соединений.

В последние годы появились и другие высокоэффективные методы, одним из которых является SOS-хромотест. Данный тест основан на современных представлениях о механизме мутационного процесса, как следствия функционирования SOS-репарации. Обнаружение непосредственной связи между индукцией мутации и других SOS-функций позволило разработать ряд новых экспресс-методов для скрининга мутагенов. К ним, в частности, относится SOS-хромотест.

В клетках E.coli SOS-ответ включает ряд функций, которые индуцируются в ответ на повреждение ДНК или остановку ее синтеза. Одна из SOS-функций, контролируемая геном sfiA, выражается в ингибировании клеточного деления и нитевидном росте. В клетках тестерного штамма E.coli pQ 37 под контроль промотора гена sfiA введен структурный ген – β-галактозидазы (Quillardet P. et. al.,1982). Таким образом, активность β-галактозидазы, определяемая колориметрически по интенсивности цветной окраски на этот фермент, непосредственно зависит от степени экспрессии гена sfiA и является показателем индукции SOS-функции.

Чувствительность и специфичность SOS-хромотеста, по данным изучения 60 известных и 13 неканцерогенных соединений, равны, соответственно, 75 и 100%. Те же самые показатели теста Эймса по отношению к этим же 73 веществам составляли 78 и 62%. Обращает на себя внимание высокая специфичность SOS-хромотеста, т.е. отсутствие ложно-позитивных результатов. Низкая специфичность теста Эймса в данном случае (62%) объясняется наличием среди изучаемых веществ таких неканцерогенных мутагенов, как азид натрия, 2-аминопурин, афлатоксин G2, азоксибензол и бенз[а]пирен. Хотя последние 3 соединения можно отнести к веществам с очень слабо выраженной канцерогенной активностью. Чувствительность SOS-хромотеста (75%) в данном случае ниже, чем теста Эймса (78%). Это вызвано тем, что бензидин, циклофосфамид и этилен дихлорид не вызывали индукции SOS-ответа.

При изучении активности в данном тесте производных фенантренхинона, флуоренона и дифенила, индуцирующих мутации сдвига рамки считывания у штамма S.typhimurium TA 1538, обнаружено, что способность их вызывать SOS-ответ зависит от химического строения (С.В.Васильева и др., 1989). Отмечено, что SOS-ответ индуцирует только те соединения, химическая структура которых позволяет ковалентное взаимодействие с ДНК. Кроме того, эти соединения обладают копланарной дифенильной структурой. Некопланарные структуры нитродифениловых кислот, их амидов и эфиров не проявили активности в SOS-хромотесте, несмотря на наличие у некоторых из них значительной мутагенной активности. По-видимому, свободная некопланарная структура производных дифенила при присоединении к ДНК в меньшей степени изменяет структуру последней, чем жесткие копланарные молекулы флуоренонов и фенантренхинонов. Это обстоятельство может быть существенным для индукции SOS-ответа.

Анализ имеющихся данных показывает, что SOS-хромотест может дополнить тест Эймса на мутагенез в следующих аспектах:

-обнаружение канцерогенов, проявляющих мутагенность только при активации в жидкой среде;

-установление токсичных для бактерий соединений, таких как противоопухолевые препараты блеомицин, неокарциностатин и митомицин С, которые идентифицируются в тесте Эймса как мутагены только на штамме S.typhimurium TA 102;

-для определения антиметаболитных ингибиторов синтеза ДНК.

Главным    преимуществом SOS-хромотеста является его практичность. Используется всего один штамм. Это очень важно, так как увеличение числа штаммов, как это делается в тесте Эймса с целью повышения его чувствительности, усложняет и удорожает работу. Количественный колориметрический ответ может быть получен в течение нескольких часов.

Основной недостаток SOS-хромотеста заключается в том, что не обнаруживает активности большинства интеркалирующих в ДНК агентов.

Среди используемых в качестве тест-объектов эукариотических микроорганизмов широкое применение нашли наиболее изученные виды Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans. Включение грибов в число тест-систем для выявления мутагенов вызвано, по крайней мере, двумя обстоятельствами (И.А.Захаров и др., 1980). Во-первых, накопление мутагенов в окружающей среде создает опасность ускорения темпов мутирования таких вредных организмов, как фитопатогенные микроорганизмы. Мутагенные пестициды, повышая темп мутирования фитопатогенов, могут оказаться одним из факторов, способствующих появлению новых рас патогенов. Поскольку среди фитопатогенов грибы занимают доминирующее положение, желательно чтобы представители этих организмов служили в качестве тест-объектов для оценки возможной генетической опасности пестицидов и других загрязняющих окружающую среду веществ.

Во-вторых, грибы позволяют совмещать простоту выполнения экспериментов с возможностью учитывать широкий круг генетических эффектов, характерных именно для эукариотической клетки.

Дрожжи-сахаромицеты позволяют регистрировать широкий спектр генетических эффектов: генные мутации, митотические рекомбинации, потерю хромосом и митохондриальные мутации. При учете генных мутаций применяются либо количественные методы, когда клетки обрабатываются мутагеном в суспензии с последующим высевом их на полноценную и селективную среды, либо качественные, когда мутаген наносится на поверхность селективной среды в чашках Петри. На соответствующей селективной среде могут быть выявлены обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности или мутанты, устойчивые к определенному фактору.

Чаще всего у дрожжей учитывают митотическую рекомбинацию. Это связано с тем, что частота митотической рекомбинации бывает намного выше, чем генных мутаций, что облегчает ее регистрацию. Сконструированы специальные штаммы Saccharomyces cerevisiae D3, D4, D5 и другие, позволяющие учитывать рекомбинационные события.

Штамм D3 используется для учета реципрокных митотических рекомбинаций и представляет собой компаунд по комплементирующим аллелям гена ade2. Гетерозиготные по ним клетки прототрофны и образуют на плотной среде белые колонии. При выщеплении гомозигот по одной из аллелей образуются красные или розовые колонии. В случае реципрокной рекомбинации кроссинговер вырастают секторные красно-розовые колонии.

Штамм D4 применяют для учета генной конверсии (нерецирокная рекомбинация). Он представляет собой компаунд по некомплементирующим аллелям ade2 и trp5. Клетки не растут на минимальной среде и появляющиеся прототрофы являются результатом внутригенной рекомбинации. Частота индуцированной конверсии достигает до 10-3.

Введение в генотип таких штаммов мутаций, блокирующих репарацию, существенно повышает их чувствительность к химическим мутагенам. Ряд перспективных штаммов дрожжей-сахаромицетов для оценки генетической активности химических веществ получен сотрудниками сектора радиационной генетики Ленинградского института ядерной физики АН СССР и кафедры генетики и селекции Ленинградского государственного университета (И.А.Захаров и др., 1975-1981; Ю.И.Павлов и др., 1980-1981).

В 1969 году M.G.Gabridge и M.S.Legater предложили метод, который позволяет с помощью индикаторных бактерий выявлять мутагенную активность метаболитов тестируемых веществ in vivo. Внутрибрюшинно мышам, использованным в качестве посредника, инъецировали суспензию бактерий индикаторного штамма S.typhimurium G-46, в внутримышечный раствор канцерогена диметилнитрозамин (ДМНА). Через 3 часа культуру извлекали из животных и определяли частоту обратных мутаций к независимости по гистидину. Параллельно бактерии обрабатывали ДМНА в условиях in vitro. Было показано, что ДМНА, не проявляющий мутагенной активности в экспериментах in vitro, проявляет мутагенную активность in vivo.

Таким образом, впервые была показана возможность обнаружения мутагенной активности метаболитов химических соединений, введенных животному. Данный метод метаболической активации химических соединений in vitro – «метод с млекопитающим-посредником» (Host=mediated assay) – получил широкое распространение. С его помощью в разных лабораториях исследованы сотни веществ, некоторые из которых индуцировали мутации у индикаторных организмов только после метаболической активации. К ним относится ряд известных канцерогенов (ДМНА, диэтилнитрозамин, N-нитрозоморфолин, бензпирен и др.), противотуберкулезное средство тубазид (изониазид), цитостатики: циклофосфамид, изофосфамид, микотоксин, афлатоксин B1 и другие вещества.

Из микроорганизмов в качестве индикатора применяются хорошо изученные в генетическом отношении про- и эукариотические организмы. Наибольшее распространение получили ауксотрофные штаммы S.typhimurium, обладающие высокой чувствительностью к химическим мутагенам и позволяющие различать вещества по их первичным механизмам мутагенного действия. Другими бактериальными тестерами являются ауксотрофные штаммы E.coli, Serratia marcescens, а также штамм E.coli K-22 343/113, который позволяет обнаружить индукцию как прямых, так и обратных мутаций.

Из эукариотических микроорганизмов в качестве индикатора в тесте с млекопитающим-посредником успешно используются дрожжи, которые можно вводить в кровяное русло, брюшную полость, семенники и другие органы крыс.

Традиционный тест с животным-посредником включал, как описано выше, введение индикаторных клеток в брюшную полость и выделение их через определенное время после обработки хозяина тестируемым соединением. Позже были разработаны различные модификации метода, позволяющие привести индикаторные клетки в более тесный контакт с органами, где происходит биотрансформация исследуемого соединения, или с репродуктивными органами хозяина.

Наиболее распространенным способом введения индикаторных микроорганизмов в различные органы млекопитающего является введение их прямо в кровяное русло путем инъекции в хвостовую вену животного. Мышам внутрибрюшинно или внутрижелудочно вводят раствор изучаемого соединения в необходимой дозе, а в хвостовую вену – 0,2-0,3 мл бактериальной суспензии (1011 клеток/мл). Через 1 час животных забивают, извлекают печень и гомогенизируют ее для осаждения бактерий. Бактерии ресуспендируют в буфере и высевают на чашки с селективной и полноценной средами. Таким же  образом определяют мутагенное действие изучаемого соединения на бактерии, осевшие в легких, почках и селезенке.

Метаболическая активация химических соединений in vitro является удобным методом прогнозирования генетических последствий комбинированных воздействий. Ярким примером тому служат результаты изучения комбинации нитрита натрия с аминами. Показано, что внутрижелудочное введение мышам диметиламина и нитрита натрия повышало частоту мутаций у штамма S.typhimurium G-46 в 4 раза, этилмочевина + нитрит натрия – в 10 раз, а метилмочевина + нитрит натрия – в 850 раз. Анальгин и амидопирин, введенные совместно с нитритом натрия внутрь мышам NMLI также индуцировали мутации у бактерий S.typhimurium. Подобные ситуации имеют место в реальной жизни. Нитрит натрия является одним из ковервантов, используемых в пищевой промышленности, а амины поступают в виде лекарств или образуются при распаде белков.

В экспериментах с млекопитающим-посредником показано усиление или снижение активности непрямых мутагенов другими соединениями, влияющими на их метаболизм. К ним относят индукторы и ингибиторы ферментов микросом.

Мутагенный эффект, индуцированный химическим соединением у микроорганизмов, инкубируемых в брюшной полости животных, зависит от концентрации активного агента в участке, где находится тест-культура, и от времени, в течение которого осуществляется контакт мутагена с бактериями. Это, в свою очередь, зависит от таких характеристик поведения препарата в организме животного, как всасывание, распределение по органам и тканям, метаболизм препарата и скорость выведения его из организма. Эти процессы определяются генетическими (видовые и линейные), физиологическими (возраст, пол, режим питания, наличие беременности, заболевания) особенностями организма и факторами внешней среды. Влияние генетических факторов на животных хорошо изучено на примере изониазида и ДМНА. Разную активность показал изониазид на штамме S.typhimurium G-46 при использовании для его активации двух линий мышей и разных видов животных: мышей, крыс, морских свинок, китайских и сирийских хомячков. Различные результаты получены и при исследовании способности 1-(пиридил-3)-3,3-диметилтриазена и эндоксана индуцировать митотические генные конверсии у дрожжей, инкубировавшихся в брюшной полости мышей и крыс.

Заслуживает особого внимания попытка моделирования патологического состояния в экспериментах с  млекопитающим-посредником, которое создавалось адреналэктомией мышей (А.А.Шапиро, Л.М.Фонштейн, 1979). Адреналэктомия, как известно, приводит к тотальным функциональным нарушениям организма, в том числе к изменению его гормонального статуса. Изучение метаболической активации циклофосфана в организме 3-х групп мышей: контрольных, ложно адреналэктомированных и адреналэктомированных мышей показало, что данный промутаген проявляет большую мутагенность на бактериях Salmonella typhimurium TA 1950 в варианте с адреналэктомированными животными. Данный пример указывает на возможность обнаружения функциональных сдвигов в организме с помощью бактерий.

3.2. Цитогенетические методы

Главный недостаток методов, основанных на использовании низших организмов, заключается в невозможности экстраполировать полученные результаты на человека в связи с отсутствием процессов метаболической активации и детоксикации, характерных для всех млекопитающих, включая человека. На практике этот недостаток частично восполняется применением экзогенной системы метаболической активации in vitro. Однако метаболическая активация in vitro может характеризовать только начальные этапы метаболизма и соответственно не дает полного представления о судьбе вещества в целом организме. Поэтому методы, выполняемые на млекопитающих in vitro, имеют несомненно положительные стороны и позволяют регистрировать конечные результаты действия вещества. Для изучения мутагенных эффектов генотоксичных агентов in vivo разработаны различные методы (один из них – метод щелочной элюции ДНК). Наиболее распространенными являются цитогенетические методы. Они включены в качестве одного из основных в общепринятые наборы тест-систем оценки мутагенности химических соединений.

Существует высокая корреляция (более 90%) между способностью химического агента вызывать разрывы хромосом и генные мутации. Несмотря на то, что механизмы этих двух явлений в большинстве случаев различны, цитогенетическая активность вещества может указывать и на его способность индуцировать генные мутации.

В цитогенетических тестах анализируется весь геном целиком непосредственно в микроскоп, что имеет большое значение в случае соединений, которые имеют специфические участки действия (горячие точки). Еще одним преимуществом является то, что эти методы выполняются сравнительно быстро и со сравнительно скромными затратами. Ниже описываются часто используемые цитогенетические методы, выполняемые как in vitro, так и in vivo.

Учет хромосомных аберраций. Изменение числа и структуры хромосом в соматических клетках и зародышевых клетках могут возникать спонтанно или после воздействия физическими и химическими агентами. Нарушения хромосом, возникающие в зародышевых клетках, приводят к разнообразной врожденной патологии у человека. Эти нарушения принято относить к мутациям, которые могут быть разделены на геномные в случае изменения числа хромосом и хромосомные – при структурных нарушениях.

Многочисленные работы последних лет свидетельствуют о том, что накопление хромосомных мутаций в соматических клетках является одним из факторов, индуцирующих развитие клонов злокачественных клеток, а также процессы старения.

Анализ хромосом соматических клеток методически хорошо разработан. Аномалии хромосом в экспериментальных условиях можно индуцировать различными агентами в клеточных культурах и в соматических клетках лабораторных животных in vivo. В последнем случае обычно в качестве модели используют клетки костного мозга животных.

Все хромосомные аберрации, возникающие в соматических клетках человека и животных, учитываемых на стадии метафазы, разделяют на 2 основные группы: хромосомные и хроматидные. Отнесение той или иной аберрации к хромосомному или хроматидному типу зависит от того, на каком уровне (хромосомы или хроматиды) повреждена хромосома, включенная в перестройку.

Аберрации хромосомного типа отражают повреждение хромосомы на предсинтетической стадии (G1-фаза), когда она представляет собой однонитевую структуру, тогда как аберрации хроматидного типа возникают при повреждении хромосомы на двунитчатой стадии, то есть в фазе S и G2. Нередко при повреждении обеих хроматид хромосомы в идентичных локусах возникают изохроматидные разрывы, морфологически неотличимые от аберраций хроматидного типа. Аберрации могут быть простыми и обменными. Нарушение целостности одной или нескольких хромосом с образованием свободных или связанных с ней фрагментов относят к простому типу аберраций, тогда как перестройка участков одной и той же хромосомы или перекомбинации участками между несколькими хромосомами – к обменному типу.

Обменные аберрации могут быть внутрихромосомными и межхромосомными. В зависимости от локализации внутрихромосомные аберрации разделяют на внутриплечевые и межплечевые. При межхромосомных обменах, если ацентрические фрагменты соединяются с центрическими, то обмены классифицируют как симметричные, а в случае соединения центрических фрагментов – как асимметричные. В последнем случае обмен характеризуется появлением полицентрических хромосом и хроматид. Внутрихромосомные и межхромосомные обмены могут быть полными и неполными. При полных обменах происходит воссоединение всех перекомбинирующихся участков поврежденных хромосом.

Культура лейкоцитов человека широко используется для изучения радиационного и химического мутагенеза у человека. Изменения лейкоцитов периферической крови человека в процессе культивирования в присутствии ФГА достаточно исследованы.

При таком культивировании происходит гибель всех форм лейкоцитов за исключением малых лимфоцитов, которые претерпевают изменения, приводящие к митозу. Поэтому при анализе митотических клеток, по существу, имеем дело с культурой лимфоцитов.

К достоинствам культуры лимфоцитов человека относятся доступность материала, синхронность клеточной популяции, низкий уровень спонтанного мутирования, отработанность техники культивирования и изученность морфологии хромосом.

Для целей тестирования используют микро- или полумикрометод культуры лимфоцитов. Анализ хромосом проводят на метафазных пластинках с хорошо окрашенными и разбросанными хромосомами. При этом метафазные пластинки не должны иметь большое количество наложений хромосом и уровень конденсации их должен быть таким, чтобы акроцентрические хромосомы были видны в виде четко выраженных структур. Но анализируются метафазные пластинки с хромосомами, вошедшими в анафазу, так как трудно дифференцировать их от парных фрагментов. Из-за технических манипуляций возможны потери хромосом в пластинке. Поэтому при учете хромосомных аберраций обычно анализируется клетка с числом хромосом от 44 до 47.

При тестировании химических соединений на мутагенную активность хромосомные аберрации учитывают без кариотипирования. Кариотипирование метафазной пластинки применяют в специальных исследованиях, например, при изучении распределения повреждений по группам хромосом, их длине.

Долгое время спорным являлся учет пробелов (брешей) в качестве аберраций. В настоящее время принято пробелы регистрировать отдельно, не включая их в число учитываемых аберраций. Частота пробелов в значительной степени зависит от качества окраски и степени спирализации хромосом.

О мутагенной активности судят по частоте хромосомных аберраций, превышающей спонтанный уровень в норме. Типы индуцированных химическими мутагенами аберраций, как правило, аналогичны типам спонтанных аберраций.

При тестировании химических соединений эксперименты проводят в два этапа. Первый этап предполагает обнаружение возможного эффекта вещества в максимальной концентрации, обработку культур проводят на 48 часу роста и фиксируют клетки на 72 часу. При наличии эффекта переходят к изучению зависимости доза-эффект (2-й этап).

Костный мозг млекопитающих является наиболее широко используемой моделью для исследования мутагенной активности химических соединений in vivo. Это связано, во-первых, с тем, что клетки костного мозга имеют высокую пролиферативную активность и, во-вторых, простотой приготовления препаратов. Морфология хромосом большинства видов лабораторных животных хорошо изучена.

Тестирование обычно проводят на мышах, анализируют и учитывают как число метафаз с аберрациями, так и общее число структурных нарушений хромосом.

Клетки костного мозга асинхронны и для установления наиболее чувствительной стадии клеточного цикла анализируют различные клеточные популяции, зафиксированные в различные сроки после воздействия. Рекомендуют фиксировать клетки через 6, 24 и 48 часов после введения животным тестируемого агента.

Уровень хромосомных аберраций в клетках костного мозга достаточно низок и составляет у большинства линий лабораторных мышей 1-2%.

Для работы обычно выбирают линии с низкой и стабильной частотой (=1%) спонтанных аберраций. Мыши CBA/L acY, F1(C3Hx101) и F1(CBAxC57 BL/6) имеют низкий уровень спонтанных аберраций. Однако они по чувствительности к действию ряда мутагенов существенно отличаются друг от друга.

Метод учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих является составной частью практически всех комплексов методов оценки мутагенных свойств у химических веществ, принятых почти во всех странах мира проводящих такую оценку.

Сестринские хроматидные обмены. Феномен обмена участками между сестринскими хроматидами одной хромосомы привлек внимание исследователей мутагенных факторов окружающей среды своей высокой чувствительностью. Так, изучение уровней индукции СХО и хромосомных аберраций при действии 5 мутагенными агентами на лимфоциты человека in vitro и на клетки костного мозга мышей in vivo показало, что эффективность индукции СХО in vitro в 300-30 раз превышает эффективность образования аберраций хромосом. Та же закономерность сохранялась при действии in vivo, но соотношение снижалось до 60-20 раз (Щеглова Е.Г., Чеботарева А.Н., 1985).

Принцип метода обнаружения СХО заключается в воздействии на клетки таким образом, чтобы две сестринские хроматиды отличались друг от друга. Достигается это введением в растущую культуру клеток 5-бромдезоксиуридина (БДУ) с последующей окраской препаратов. БДУ присутствуют в среде в течение двух клеточных циклов. Хроматиды, включившие БДУ в обе субъединицы, выглядят на окрашенных препаратах более светлыми, чем хроматиды, включившие его в одну субъединицу или не включившие вообще. Данный подход был предложен А.Ф.Захаровым и Н.А.Еголиной (1972) и является основой всех современных методов обнаружения СХО, так как все последующие разработки сводятся лишь к использованию различных красителей для различения двух сестринских хроматид, в разной степени включивших БДУ.

Природа СХО до сих пор остается не выясненной и этой проблеме посвящено много работ. Основной вопрос заключается в том, что следует ли считать СХО прямым генетическим эффектом или следствием определенных типов повреждений ДНК. В этой связи понятен интерес исследователей к выяснению взаимосвязи между СХО, мутагенезом и повреждениями ДНК.

Клетки китайского хомячка V 79 обрабатывали различными химическими веществами и исследовали взаимосвязь между повреждениями ДНК, токсичностью, мутагенностью и индукцией СХО. Транс-Pt (II) диаминодихлорид, не являющийся мутагеном, приводил к образованию почти такого же количества СХО, как и высокомутагенный цис-Pt (II) диаминдихлорид. Поскольку эти препараты не приводят к образованию однонитевых разрывов в ДНК, то можно было предположить, что СХО является следствием каких-то других повреждений, например, сшивок ДНК-ДНК или ДНК-белок. Транс-Pt (II) образует почти в 20 раз больше сшивок ДНК-белок, чем цис-Pt (II), однако количество сшивок ДНК-ДНК в этих случаях одинаково. Таким образом, было показано, что существует более тесная связь между СХО и сшивками ДНК-ДНК. В этой же работе тесной связи между частотой СХО, мутагенностью и токсичностью изучаемых агентов не обнаружено. Вместе с тем, имеется и много других противоречивых данных о взаимосвязи между СХО и другими генетическими эффектами.

Методика проведения эксперимента по учету СХО в культурах лимфоцитов человека и в различных клеточных линиях хорошо разработана.

В последние годы разработана методика учета СХО в клетках эмбриона, подвергавшегося трансплантарному воздействию изучаемым агентом in vivo. Параллельно изучают уровень СХО в клетках костного мозга матери. Эксперименты проводятся по следующей схеме:

       обработка животных тестируемым веществом;

       подкожная имплантация БДУ;

       введение колхицина для остановки митозов и задержки клеток в

метафазе;

   приготовление препаратов клеток плода и клеток костного мозга матери для последующего окрашивания флуорохромом и цитогенетического анализа.

Способ имплантации БДУ изучался в ряде специальных работ. Показано, что метод частичного парафинированного покрытия таблеток БДУ перед подкожной имплантацией их мышам способствует поступлению этого вещества в клетки в течение 24, а не 8 часов и позволяет получить за 34 часа четкие метафазы I, II, III делений с дифференциальной окраской сестринских хроматид. Полагают, что парафиновое покрытие более удобно, чем агаровое из-за своей простоты приготовления таблеток, а также возможности немедленного поступления БДУ в ткани животных.

Учет СХО в клетках человека (лимфоциты) in vitro является одним из дополнительных методов оценки генетической активности химических соединений.

Микроядерный тест. Метафазный анализ, который используется при учете хромосомных аберраций в соматических клетках животных и человека, требует много времени и высокой квалификации исследователя. Поиск же новых принципов учета структурных нарушений хромосом был направлен на упрощение метода. В 1973 г. J.A.Heddle и W.Schmid независимо друг от друга предложили микроядерный тест, основанный на учете микроядер в полихромных эритроцитах костного мозга. Первоначально он был разработан для эритроидных клеток костного мозга, а позже тест стал применяться для учета микроядер в ранних сперматидах, печени плода при изучении трансплацентарной активности химических соединений, в клетках слизистой рта, лимфоцитах человека, в клетках печени и толстой кишки животных. К настоящему времени учет микроядер стал возможен в большинстве популяций делящихся клеток.

Микроядерный тест в силу своей простоты и возможности быстрого анализа стал методом скрининга химических соединений на цитогенетическую активность in vitro. Микроядра возникают из фрагментов хромосом, которые лишены центромер и поэтому исключаются из клеточных ядер в момент деления клеток. Иными словами, они являются ацентрическими фрагментами, возникшими в результате структурных нарушений хромосом и не попавшими во вновь формирующееся ядро при делении клеток. Кроме того, они могут образовываться из хромосом, оставшихся в анафазе. Тем самым результаты учета микроядер отражают результаты кластогенного действия на хромосомы изучаемого соединения.

Наиболее распространенным методом является учет микроядер в полихромных эритроцитах и испытано этим большое количество соединений. Это связано с тем, что полихромные эритроциты (ПХЭ) легко распознаются, имеют короткий жизненный цикл и любое содержащееся в них микроядро является следствием хромосомных аберраций в эритробластных клетках, возникших спонтанно или индуцированных исследуемыми агентами.

Существуют три способа тестирования химических веществ микроядерным тестом. Они различаются по режимам обработки и срокам фиксации клеток после обработки.

Схема проведения эксперимента, прежде всего, зависит от поставленной задачи. Тестирование проводят в два этапа. Первый этап эксперимента предполагает выявление возможного эффекта. При этом используют максимально переносимую дозу, близкую к LD50 (приблизительно 80% от LD50) или ½ LD50. Тестируемое вещество чаще всего вводят мышам внутрибрюшинно двукратно с интервалом в 24 часа и фиксацией клеток костного мозга через 6 часов после второго введения. Имеются работы с многократным (до 5 раз) введением тестируемого вещества. Проведено сравнительное изучение индукции микроядер алкилирующими агентами и антиметаболитами при однократном и многократном (5 раз) воздействиях. Однократно обработанных животных забивали через 30 часов, многократно – спустя 6 часов после последней дозы. Оба режима воздействия были эффективны в выявлении активности изучаемых соединений, хотя для оценки антиметаболитов лучшим был режим пятикратной обработки.

Большое количество работ посвящено оптимальным срокам фиксации клеток. Как было описано выше, теоретически через 24-30 часов после однократного воздействия можно зарегистрировать максимальное число микроядер. Исходя из этого, было рекомендовано фиксировать клетки через 6 часов после второго введения вещества, т.е. через 30 часов после первого введения. Однако при изучении эффектов ряда химических соединений при различных сроках фиксации клеток обнаружено, что по ряду причин максимальная частота микроядер наблюдается в более поздние сроки. Такой пик был зарегистрирован для митомицина С через 30-36 часов, циклофосфамида – 42-48 и 7,12-диметилбензантрацена – 60-72 часа после однократного введения мышам (Salamone M.F., Heddle J.A., 1983). Известно, что генетические эффекты двух последних соединений связаны с активностью их метаболитов. По-видимому, все отклонения от теоретически оптимальных сроков наблюдения микроядер связаны со скоростью метаболизма этих веществ в организме, фармакокинетикой активных метаболитов и другими факторами. Поэтому ряд авторов рекомендуют вводить животным вещества однократно в максимально переносимой дозе и фиксировать клетки для анализа через 30, 48 и 72 часа. Окрашивание препаратов обычно проводят 5%-ным раствором Гимза. Другие методы окраски направлены на более лучшую идентификацию ПХЭ и, в частности, их отличие от зрелых эритроцитов. Недавно предложен простой метод флуоресцентного окрашивания микроядер  и РНК в эритроцитах с использованием красителей Хехст 33258 и пиронина У. Двойная флуоресцентная метка микроядер позволяет отличить последний от базофильных гранул, артефактов при окрашивании и от структур, содержащих РНК окрашенные препараты, пригодные для автоматического анализа.

Hosted by uCoz